ClearColi BL21（DE3） 电感受态细胞

产品介绍

使用这种独特的工程化大肠杆菌菌株从源头上消除内毒素，以实现低内毒素蛋白表达。每个 ClearColi BL21（DE3） 电感受态细胞试剂盒包含：DUO 包装的 ClearColi BL21（DE3） 电感受态细胞（每管 2 次转化）、表达回收培养基（减乳糖）、pUC19 阳性对照质粒和完整的实验方案。表达回收培养基（减乳糖）也可单独购买。

主要特点

·   从源头上消除内毒素

·   转基因LPS不会触发人体细胞的内毒素反应

·   适用于哺乳动物细胞免疫原性检测、毒性测定和治疗性蛋白质药物发现

·   可用于膜和脂质结合蛋白的生产

·   蛋白表达与 BL21（DE3） 细胞相似，无需去除下游内毒素

·   减少细胞因子检测中的假阳性，提高结果的可信度

ClearColi 技术简介

有没有更好的方法来消除内毒素污染？答：现在有了。

与其从蛋白质或质粒 DNA 制备物中去除脂多糖 （LPS） 污染，不如从源头消除 LPS。来自新型大肠杆菌菌株的转基因 LPS 可产生功能上干净的重组蛋白和质粒。ClearColi BL21（DE3）细胞是首个具有修饰LPS（脂质IV一个- 见图1），不会触发哺乳动物细胞中的内毒性反应。ClearColi 细胞缺乏用于 hTLR4/MD-2 激活的外膜激动剂;因此，与大肠杆菌野生型细胞相比，ClearColi 对 hTLR4/MD-2 信号的激活低几个数量级，并且由 ClearColi 制备的异源蛋白几乎没有内毒活性。从 ClearColi 细胞、蛋白质或质粒中进行最低限度的纯化后，其中可能仍含有脂质 IV一个，仍然可以在大多数应用中使用，而不会引起内毒反应。

图1. 正常大肠杆菌细胞的 LPS 与转基因脂质 IV 相比一个来自 ClearColi 细胞。在 ClearColi 中，寡糖链已被删除，六个酰基链中的两个已被移除以禁用内毒素信号。

对 ClearColi 细胞基因型的修饰由七个独立的基因缺失组成，从而确保没有基因回归到野生型和产生正常 LPS 的机会。这些突变导致 LPS 中寡糖链的缺失，从而更容易去除产生的脂质 IV一个从下游产品。更重要的是，六个酰基链中的两个被删除。LPS 的六条酰基链是触发器，被 Toll 样受体 4 （TLR4） 与髓系分化因子 2 （MD-2） 复合物识别，引起 NF-ƙB 的激活和促炎细胞因子的产生。脂质IV，仅包含四条酰基链，不被 TLR4 识别，因此不会触发内毒性反应（见图 2）。

图2. 使用来自 K-12 大肠杆菌菌株或纯合成制造的脂质 IV 的纯化 LPS 在 HEK-Blue 细胞中相对 NF-κB 诱导的比较。

基因型信息

ClearColi BL21（DE3） 感受态细胞具有以下基因型：
F– ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm lon λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) msbA148 ΔgutQ ΔkdsD ΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxP ΔeptA

使用 ClearColi 进行蛋白表达

使用两种不同的重组蛋白，比较了不含内毒素的 ClearColi BL21（DE3） 感受态细胞与正常 BL21（DE3） 细胞的相对生产效率。尽管 ClearColi 的总体生长速度较慢，但最终的蛋白质生产水平非常相似（见图 3 和图 4）。

使用两种不同的重组蛋白，比较了不含内毒素的 ClearColi BL21（DE3） 感受态细胞与正常 BL21（DE3） 细胞的相对生产效率。尽管 ClearColi 的总体生长速度较慢，但最终的蛋白质生产水平非常相似（见图 3 和图 4）。

图3. ClearColi BL21（DE3） 和 Lucigen 的 E. Cloni EXPRESS BL21（DE3） 感受态细胞中蛋白表达的比较。含有携带编码人载脂蛋白A1（ApoA1）基因的T7表达质粒的细胞在37°C的LB Miller培养基中生长。 当培养物达到 OD 时6000.6 至 0.8，通过添加 0.4 mM IPTG 诱导表达，并继续孵育 3 小时。在Laemmli缓冲液中通过加热裂解等量的未诱导（-）和诱导（+）细胞，并通过SDS-PAGE在4%-20%聚丙烯酰胺梯度凝胶上分析样品。

图4. ClearColi BL21（DE3）和克隆大肠杆菌EXPRESS BL21（DE3）细胞中荧光蛋白表达的比较。在T7启动子的控制下，将带有编码黄色荧光蛋白（LucY）基因的pET表达载体转化为ClearColi BL21（DE3）和克隆杆菌EXPRESS BL21（DE3）。将菌落接种到LB-Miller培养基中，并在37°C下生长以进行诱导。将含有等量细胞的诱导细胞和未诱导细胞样品离心，并在长波长紫外线照射下拍摄细胞沉淀。

内毒性试验结果

在多数情况下，简单的镍柱纯化就足以用于适合内毒性休克反应阴性重组蛋白或下游真核细胞反应测定。研究人员现在可以测定靶向蛋白质效应，而不必担心免疫反应触发因素是LPS内毒素污染的结果。为了证明，对 ClearColi BL21（DE3） 感受态细胞表达的 ApoA1 蛋白进行了 Ni 柱纯化，并使用 Invivogen 的 HEK-Blue 细胞系（见图 5）和 LAL 测定法（见图 6）测试了内毒性。

图5. 来源于 ClearColi BL21（DE3） 和传统 BL21（DE3） 感受态细胞的蛋白质的内毒性反应的比较

ClearColi BL21（DE3） 细胞的生长速率

ClearColi BL21（DE3）细胞的生长速率约为正常BL21（DE3）细胞的50%（见图7）。用户应该期望在接种转化体后的前 24 小时内看到非常小的菌落。我们建议将培养板孵育 32-40 小时，然后再选择菌落用于未来的实验。当生长到足够的密度时，ClearColi BL21（DE3）细胞在比较相同数量的细胞时产生与正常BL21（DE3）细胞相似的蛋白质水平。

图7. ClearColi BL21（DE3） 与 E. cloni EXPRESS BL21（DE3） 细胞的生长速率比较。将细胞接种到初始 OD600在 200 ml LB Miller 培养基中为 ~0.003，并在 37°C 下以 210 rpm 振荡生长。The OD600的培养物每小时记录一次。